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改进心得 ▏更好用的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性检测试剂盒

发布日期:2021-06-18 13:58 浏览次数:

1. 谷胱甘肽过氧化物酶简介

谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶,可以清除活细胞内的过氧化物,保护细胞免受自由基损伤。GPx催化还原型谷胱甘肽(GSH)还原H2O2和多种有机过氧化物,从而消除活性氧的毒害作用。
 

2. GPx活性测定受到粗酶液中过氧化氢酶的干扰

GPx可以催化2 GSH氧化生成1 GSSG,而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化1 GSSG产生2 GSH,其中GPx是限速酶。因此,通过检测NADPH的减少速率即可计算GPx活性。H2O2是最常见的过氧化物,以往雷火的试剂盒也是采用了H2O2作为底物。
但是底物H2O2也可以被粗酶液中普遍存在的过氧化氢酶(Catalase)催化分解,干扰GPx活性测定。在样本中CAT活性不高的情况下,这种干扰不会对测定产生显著影响。但当遇到肝脏等CAT活性较高的样本时,会极大干扰GPx测定。

 
3. GPx测定方法的改进思路

要避免CAT干扰,主要有两种思路。一种是去除或抑制CAT的活性,另一种是选择不受CAT催化反应的底物。常见的CAT抑制剂有叠氮化钠等。但是叠氮化钠属于危险化学品。
GPx可以催化还原多种有机过氧化物,而CAT则不会与有机过氧化物发生反应。参考了文献报道,并进行实验验证后,雷火选用了叔丁基过氧化氢作为底物。叔丁基过氧化氢不会与GSH发生自发性反应,也不会被CAT催化分解。同时,叔丁基过氧化氢不会被不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶催化,因此可以特异性的检测最常见的含硒的GPx活性。

 
4. 改进后谷胱甘肽过氧化物酶活性测定试剂盒的优势

4.1 适用于不同类型的样本
可测定动植物组织、血清等(图1)。


图1:不同样本GPx吸光值差值对比

4.2 受到CAT干扰更小,反应稳定性更好
图2显示,在CAT的干扰下,吸光值出现无规律的剧烈波动,这是因为CAT消耗了底物,同时产生大量气泡,极大干扰了测定。


图2:改进前的小鼠肝脏样本10分钟内吸光值变化

图3显示,改进后,CAT的干扰被排除,吸光值稳定下降,并最终耗尽底物进入平台期。

     

图3:改进后的小鼠肝脏样本10分钟内吸光值变化

 
5. GPx活性检测试剂盒改进体会

酶活性测定中,除了要保证测定原理可靠外,更要注意干扰物质的影响。在谷胱甘肽过氧化物酶活性测定试剂盒中,雷火通过谷胱甘肽还原酶间接测定GPx活性,屏蔽了一部分干扰。而在此次改进中,雷火使用特异性更强的底物,将底物可能产生的干扰也降到最低,才保证了测定结果的稳定可靠。
这次改进的过程中我认识到,必须从源头开始,利用底物、酶、反应原理的特异性,逐步排除干扰,才能得到真正可靠的试剂盒。
雷火试剂盒都是自主研发的,经过了各种各样生物样本实际测定的检验,并且根据试剂盒用户的反馈和雷火代测员工的报告,对试剂盒加以改进,以确保试剂盒的质量。此外,雷火特别强调并且协助用户做好预实验和预测定,必要时雷火对用户测定结果进行验证,以保证样本质量可靠和测定结果真实。
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扩展阅读:
1. 关于试剂盒和代测服务用户顾虑的说明
/a/news/kemingguandian/2018/1012/1398.html
2. 及早咨询,如实沟通和友好协商
/a/news/kemingguandian/2018/1113/1406.html
3. 用好生化测定外包的用户因素
/a/news/kemingguandian/2019/0423/1798.html
4. 用好生化测定外包的供应商因素
/a/news/kemingguandian/2019/0509/1807.html
5. 推荐《生化测定及其外包常见问题解答》
/a/news/kemingguandian/2019/0513/1809.html
6. 过度营销,谋财害命!!!
/a/news/kemingguandian/2019/0531/1817.html
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/a/news/kemingguandian/2019/1125/1880.html
8. 2021雷火电竞安卓唯一的建议
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